PicoGreen雙鏈DNA熒光定量測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 PicoGreen雙鏈DNA熒光定量測(cè)定試劑是一種旨在通過使用PicoGreen熒光染料與樣品中雙鏈DNA的高度特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號(hào)來定量樣品中DNA含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種原核生物和真核生物的細(xì)胞或組織DNA以及環(huán)境中DNA含量分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，高度敏感。 技術(shù)背景 作為DNA染色劑之一的PicoGreen熒光染料特異性地與樣品中雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。PicoGreen技術(shù)可以檢測(cè)到低達(dá)0.5納克雙鏈DNA的變化。DNA的微量增加引起熒光信號(hào)強(qiáng)度（Intensity）或相對(duì)熒光單位（RFU）的顯著增加。其自發(fā)熒光（Autofluorescence）忽略不計(jì)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差異（Standard Deviation）低，不受樣品化學(xué)成分的干擾。 產(chǎn)品內(nèi)容 染色液（Reagent A） 62.5微升 稀釋液（Reagent B） 15 毫升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C） 1毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存染色液（Reagent A）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent A）避免光照，有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器 比色皿或96孔板：用于熒光分析的容器 熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析 實(shí)驗(yàn)步驟 一、測(cè)定準(zhǔn)備 1．準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里 2．設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)480nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm，并置零 3．實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置于冰槽里融化。然后移出5毫升稀釋液（Reagent B）到新的15毫升離心管，加入25微升染色液（Reagent A），混勻后，用錫紙包裹，標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。 二、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 1．準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管 2．分別加入500微升稀釋液（Reagent B）到每個(gè)離心管 3．移取500微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到1號(hào)管，混勻 4．小心移取500微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到2號(hào)管，混勻 5．小心移取500微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到3號(hào)管，混勻 6．小心移取500微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到4號(hào)管，混勻 7．將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管含量見下表 管號(hào) 緩沖液（Reagent B） 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C） 標(biāo)準(zhǔn)DNA總量 1 500微升 500微升 1微克 2 500微升 500微升1號(hào)管 0.5微克 3 500微升 500微升2號(hào)管 0.25微克 4 500微升 500微升3號(hào)管 0.125微克 5 500微升 空對(duì)照 0 8．移取500微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿 9．加入500微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液 10．室溫下，孵育5分鐘，避免光照 11．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU） 12．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至11四次 13．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位（RLU）；橫坐標(biāo)（X軸）為DNA含量（微克） 三、樣品檢測(cè) 1．移取500微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿 2．加入500微升待測(cè)樣品 3．室溫下，孵育5分鐘，避免光照 4．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU） 5．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)DNA含量（微克） 6．樣品實(shí)際DNA濃度： [根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)DNA含量（微克）X樣品稀釋倍數(shù)]0.5（樣品容量；毫升）=微克/毫升 注意事項(xiàng) 1．本產(chǎn)品為20次（比色皿）和100次（96孔板）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 2．操作時(shí)，須戴手套 3．使用新鮮配制的染色工作液，務(wù)必不要超過2小時(shí)，且注意避光 4．建議使用塑料管配制染色工作液，而不是玻璃制品 5．孵育時(shí)，避免光照 6．系統(tǒng)檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定1次即可；如果儀器更換，則需要重新測(cè)定1次 7．如果熒光讀數(shù)過高，可以相應(yīng)稀釋樣品量 8．可以使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，試劑用量和體系均除以5，包括標(biāo)準(zhǔn)DNA含量，其計(jì)算公式： [根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)DNA濃度（微克）X樣品稀釋倍數(shù)]÷0.1（樣品容量；毫升）＝微克/毫升 9．鹽類、尿素、乙醇、lv仿、去垢劑、蛋白、瓊脂糖、單鏈DNA和RNA不會(huì)干擾檢測(cè) 10．本公司提供系列DNA檢測(cè)試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定高度敏感