細胞色素P450亞酶1A2活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞色素 P450 亞酶 1A2 活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)中甲氧基異酚噁唑轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮后熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞或組織裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品細胞色素 P450 亞酶 1A2 的總活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細胞色素P450亞酶1A2，簡稱為CYP1A2，是肝細胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一，也是芳香族碳氫化合物加羥基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成員之一。在人體肝臟里占P450酶系15％。與

CYP1A1高度同源，特別是在外顯子2、4、5和6。CYP1A2由多個多態(tài)性變體，常見的是：1A和1F，與ka fei yin代謝和遲發(fā)性皮膚卟啉癥（porphyria cutanea tarda）相關(guān)。CYP1A2的作用在于體內(nèi)外源化合物（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化

作用（hydroxylation）,以及脂類合成包括膽固醇和類固醇。芳香族碳氫化合物誘導(dǎo)CYP1A2的表達。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶（7－methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是細胞色素P450亞酶1A2的診斷標記，其基于MROD選擇性催化細胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑（7－methoxyresorufin）在甲氧基異酚噁唑脫甲基酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長530nm，

散發(fā)波長590nm），來定量測定細胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent C）和 標準液（Reagent D）避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于標準樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)比色皿或酶標板：用于反應(yīng)和比色的容器

熒光分光光度儀或酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為 37℃）：激發(fā)波長 530nm，散發(fā)波長 590nm，并置零

3． 準備好 5 個 1.5 毫升離心管，標記為 1 至 5 號管4． 加入 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到 1 號管5． 分別加入 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到 2 至 5 號管

6． 移取 xx 微升 標準液（Reagent D）到 1 號管，混勻

7． 小心移取 xx 微升 1 號管稀釋的 標準液（Reagent D）到 2 號管，混勻8． 小心移取 xx 微升 2 號管稀釋的 標準液（Reagent D）到 3 號管，混勻9． 小心移取 xx 微升 3 號管稀釋的 標準液（Reagent D）到 4 號管，混勻10．將 1 至 5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

二、 標準曲線測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升上述配制的標準液

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

7． 即刻放進熒光分光光度儀檢測獲得相對熒光讀數(shù)

8． 重復(fù)實驗步驟 1 至 7 四次

9． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y 軸）為相對熒光單位；橫座標（X 軸）為標準羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

三、 樣品測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升待測樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

7． 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相關(guān)熒光讀數(shù)

8． （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟 1 至 7，測讀新的樣品

9． 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度

四、 計算樣品活性

[根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）]＝皮摩爾/

毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

五、 酶標板測定

1． 在 96 孔酶標板上做好相應(yīng)標記：標準樣品和待測樣品2． 分別移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中

3． 分別加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

4． 分別加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

5． 分別加入 xx 微升上述配制的標準液或待測樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）

（注意：樣品須清澈）6． 輕輕搖動 96 孔酶標板7． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

8． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)

9． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y 軸）為相對熒光單位；橫座標（X 軸）為標準羥基異吩噁唑酮濃度（納摩

爾/升）

10．根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度

11．活性計算：

[根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ xx（反應(yīng)時間；分鐘）]

＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

注意事項

1． 本產(chǎn)品為 25 次（比色皿）或 85 次（酶標板）操作，包括標準液

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，標準液測定只需 1 次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒 30002.1）

5． 孵育反應(yīng)完成后即刻進行熒光測定

6． 如果酶活性過低，可以增加反應(yīng)時間至 30 分鐘

7． 熒光測定后，比色皿須清洗*

8． 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為 20 微克/100 微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為

100 至 200 微克/100 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30030.1）

9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

1. 通常人體細胞微粒體細胞色素 P450 亞酶 1A2 活性濃度為：200－600 皮摩爾/分鐘/毫克蛋白

11．細胞色素 P450 亞酶 CYP1A2 單位活性定義為：在 37℃，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化 1 納摩爾

甲氧基異酚噁唑至羥基異吩噁唑酮所需的酶量作為一個活性單位

12．本公司提供系列毒理學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感