植物種子甲磺酸乙脂突變誘導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
植物種子甲磺酸乙脂突變誘導(dǎo)試劑是一種旨在使用烷化劑甲磺酸乙酯飽和性誘導(dǎo)植物種子細(xì)胞發(fā)生變異而
產(chǎn)生基因功能缺失或獲得的種子突變株，成為篩選種子遺傳標(biāo)記和應(yīng)用分子育種的而經(jīng)典的技術(shù)方法。
該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種植物種子包括土豆、大豆、水稻等農(nóng)作
物的誘導(dǎo)突變。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，性能穩(wěn)定，突變頻率高。
技術(shù)背景
誘導(dǎo)突變（mutagenesis），包括物理（放射性）、化學(xué)、插入方法等，作為一種有效手段，用來(lái)確定和分析
生物體的基因功能，即通過(guò)基因突變所產(chǎn)生的表型變異和生理反應(yīng)。甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate；
methanesulfonic acid ethyl ether；ethylmesylate；EMS）是一種化學(xué)誘變致畸的烷化劑（alkylating agent）。
通過(guò)導(dǎo)致錯(cuò)配和堿基變異，即C/G 替換成T/A，產(chǎn)生同一基因上或基因組上隨機(jī)多樣性突變位點(diǎn)，以此發(fā)
現(xiàn)基因的功能缺失或功能獲得，以及特定氨基酸在蛋白質(zhì)中的功能所在（正向篩選）。同時(shí)進(jìn)一步分析其
單核苷酸多態(tài)性與基因功能的關(guān)系（逆向篩選），從而了解植物發(fā)育和代謝的生物學(xué)機(jī)制。
產(chǎn)品內(nèi)容
濕潤(rùn)液（Reagent A） 毫升
誘導(dǎo)液A（Reagent B） 毫升
誘導(dǎo)液B（Reagent C） 毫升
誘導(dǎo)液C（Reagent D） 毫升
誘導(dǎo)液D（Reagent E） 毫升
中和液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶(hù)自備
無(wú)離子水：用于清洗
125 毫升三角燒瓶：用于植物種子突變誘導(dǎo)的容器
平式搖蕩儀：用于混勻反應(yīng)
PARAFILM：用于密封反應(yīng)容器
通風(fēng)柜：用于安全操作的設(shè)施
花盆或農(nóng)田：用于種子播種和生長(zhǎng)
暖房：用于植物生長(zhǎng)的環(huán)境
實(shí)驗(yàn)步驟
（一） 誘導(dǎo)
1． 準(zhǔn)備好已知數(shù)量的（例如2 克或100 至5000 顆不等）等待誘變的干種子（例如土豆、大豆、水稻等種
子）（注意：用戶(hù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模梢栽黾踊驕p少種子數(shù)量）
2． 放進(jìn)4 個(gè)125 毫升三角燒瓶，標(biāo)記為1 至4 號(hào)（其中1 號(hào)為對(duì)照組）
3． 分別加入xx 毫升濕潤(rùn)液（Reagent A）
4． 放在平式搖蕩儀上，在4℃條件下孵育16 至20 小時(shí)，速度為30RPM
5． 室溫下，靜置5 分鐘
6． 分別小心移去上清液――此為M0 種子
7． 移入到通風(fēng)柜里
8． 分別加入xx 毫升濕潤(rùn)液（Reagent A）
9． 分別加入xx 毫升誘導(dǎo)液A 至D（Reagent B 至E）到相對(duì)應(yīng)的三角燒瓶1 至4 號(hào)
10．用PARAFILM 封住瓶口
11．放在平式搖蕩儀上，室溫下孵育8 小時(shí)，速度為30RPM
12．分別小心移去上清液
13．分別小心加入xx 毫升中和液（Reagent F）到三角燒瓶2 至4 號(hào)
14．放在平式搖蕩儀上，室溫下孵育20 分鐘，速度為30RPM
15．分別小心移去上清液
16．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟13 至15 一次
17．分別小心加入50 毫升用戶(hù)自備的無(wú)離子水到三角燒瓶1 至4 號(hào)
18．放在平式搖蕩儀上，室溫下孵育20 分鐘，速度為30RPM
19．分別小心移去上清液
20．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟17 至19 二次
21．分別將處理好的種子放在綿紙上16 小時(shí)，使其吸干――此為M1 種子
（二） 播種
1． 準(zhǔn)備好適量的（根據(jù)種子量，約1 個(gè)種子/cm2）8 cm X 8 cm 大小的濕潤(rùn)土壤花盆
2． 用鑷子將60 個(gè)M1 種子均勻一致地置于1 個(gè)土壤花盆中（注意：1 號(hào)對(duì)照組的M1 種子須與2、3、4
號(hào)種子分開(kāi)）
3． 放進(jìn)4℃培養(yǎng)箱里孵育2 天
4． 轉(zhuǎn)移到25℃培養(yǎng)箱里繼續(xù)孵育，日光照時(shí)間為16 小時(shí)（即16 小時(shí)光照，8 小時(shí)暗室）或置于暖房里，
接受日光規(guī)律
5． 直至數(shù)周種子長(zhǎng)葉開(kāi)花（通常5 至8 周時(shí)間）――此為M1 植物
6． 觀察植物性狀，評(píng)價(jià)突變情況：
1） 白化癥（albinism）：觀察葉綠體的色彩變化（淡綠色、黃色、白色、混合色等）
2） 胚胎致死率（embryo lethality）
3） 表皮毛狀體（trichome）
7． 用小藥勺分離來(lái)自于M1 植物（尤其突變株）的種子，并清點(diǎn)——M2 種子
方法一：?jiǎn)我患蚁邓鸭D―即每個(gè)M1 植物獨(dú)立搜集計(jì)數(shù)
方法二：集合搜集――即所有M1 植物放在一起計(jì)數(shù)
8． 客戶(hù)可以繼續(xù)M2 植物、M3 種子等的操作
9． 分析：
1） 對(duì)照組存活率（％）＝（M1 植物數(shù)÷M1 種子數(shù)）X 100％
2） 誘導(dǎo)處理存活率（％）＝（M1 植物數(shù)÷M1 種子數(shù)）X 100％
3） 誘導(dǎo)處理致死值＝誘導(dǎo)處理存活率（％）÷對(duì)照組存活率（％）
4） M1 植物生育率（％）＝（M2 種子家系÷M1 植物數(shù)）X 100％
5） 葉綠體總突變率（％）＝（非綠色M1 植物數(shù)÷總存活M1 植物數(shù)）X 100％
6） 發(fā)芽率（％）＝（發(fā)芽特征M1 種子數(shù)÷M1 種子數(shù)）X 100％
7） M2、M3 分析參照上述方法
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為5 次操作規(guī)格
2． 操作時(shí)，須戴手套；嚴(yán)格注意操作安全
3． 操作時(shí)，須在通風(fēng)柜里操作
4． 甲磺酸乙酯為有毒揮發(fā)性致畸劑，因此所有接觸過(guò)的器皿和用品都要使用0.1 M 硫代硫酸鈉（Sodium
Thiosulfate ；Na2S2O3）沖洗或中和。溶液里須加入后濃度為0.1M 硫代硫酸鈉，在室溫下孵育至少
10 分鐘，然后廢棄處理掉；
5． 如果M0 種子在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，建議使用6％次氯酸鈉溶液清洗M0 種子5 分鐘，然后用無(wú)菌無(wú)離子水
清洗4 次
6． 操作時(shí)，誘導(dǎo)液A 至D 按順序與1 號(hào)至4 號(hào)標(biāo)記對(duì)應(yīng)；其中誘導(dǎo)液A 即三角燒瓶1 號(hào)為對(duì)照組
7． EMS 誘導(dǎo)濃度超過(guò)1％，將降低突變頻率
8． 建議獲得高頻率突變的同時(shí)，發(fā)芽率須大于50％
9． 如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變株，建議（1）增加誘導(dǎo)液的孵育時(shí)間，長(zhǎng)可達(dá)48 小時(shí)；（2）增加種子數(shù)，多
可達(dá)120000
10．如果意欲建立誘導(dǎo)突變庫(kù)，建議使用10000 個(gè)M0 種子
11．根據(jù)不同植物的表型，突變觀察指征，包括種子（發(fā)芽、種苗死亡）、植物大小、植物習(xí)性（節(jié)間長(zhǎng)度、
分枝、中止生長(zhǎng)等）、葉片形態(tài)、葉片色澤、開(kāi)花時(shí)間、花序結(jié)構(gòu)、花朵形態(tài)、花朵色澤、果子大小、
果子形態(tài)、果子色澤、果子成熟時(shí)間、生育狀況、以及疾病和應(yīng)急反應(yīng)等
12．通常M2 的突變頻率為5%
13．本公司提供系列甲磺酸乙脂誘導(dǎo)突變?cè)噭┊a(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定誘導(dǎo)突變頻率高