主要用途

藍色熒光（DAPI）染色體核型分析試劑是一種旨在通過使用熒光染料DAPI與染色體DNA的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號來顯示染色體帶型特征而構(gòu)成細胞染色體核型的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。該熒光分析是細胞遺傳學中的研究技術(shù)。適用于各種生長中的動物或人體細胞。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

作為細胞DNA染色劑之一的4,6-二咪基－4-聯(lián)苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole； DAPI）特異性地與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好是UV（紫外光）的激發(fā)波長356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。通過DAPI的染色顯示其帶型特征，然后根據(jù)體細胞中全套染色體形態(tài)特征和大小順序排列，并依次配對、分組，構(gòu)成該個體的核型或染色體組型，從而可以識別和分析染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常，成為產(chǎn)前診斷或腫瘤細胞遺傳學的工具。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         毫升

滯態(tài)液（Reagent B）     毫升

低滲液（Reagent C）     毫升

固定液A（Reagent D）     毫升

固定液B（Reagent E）     毫升

預(yù)備液（Reagent F）     毫升

染色液（Reagent G）     毫升

抗淬滅劑（Reagent H）      毫升

產(chǎn)品說明書                              1份

保存方式

保存滯態(tài)液（Reagent B）和染色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；滯態(tài)液（Reagent B）、染色液（Reagent G）和抗淬滅劑（Reagent H），避免光照，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液：用于細胞培養(yǎng)

無離子水：用于清洗染色的載玻片

50毫升錐形離心管：用于細胞處理的容器

37℃恒溫水槽：用于預(yù)熱試劑溶液

臺式離心機：用于沉淀細胞

小型染色缸：用于載玻片染色的容器

載玻片：用于細胞涂片和染色

顯微鏡：用于觀察細胞分裂和染色體組型

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的固定液A（Reagent D）和B（Reagent E）從4℃的冰箱里取出，移取A液xx毫升和B液xx毫升加入到50毫升錐形離心管，混勻后標記成為固定工作液，置入冰槽里。同時在37℃恒溫水槽里預(yù)熱清理液（Reagent A）、滯態(tài)液（Reagent B）、低滲液（Reagent C）。然后進行下列操作。

• 限定細胞在有絲分裂中期（METAPHASE）

1）貼壁細胞處理

• 抽去鋪滿生長細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育3分種
• 手擊振動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 加入15毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液，充分混勻
• 移出10毫升混勻物到新的75cm2細胞培養(yǎng)瓶
• 加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液到上述新的75cm2細胞培養(yǎng)瓶
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育16至20小時
• 小心抽去鋪滿70％生長細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液
• 加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的滯態(tài)液（Reagent B），輕輕搖動細胞培養(yǎng)瓶，使其混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱，孵育2小時
• 在顯微鏡觀察下，細胞開始收縮變圓，表明細胞處于有絲分裂
• 手擊振動拍打培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 移出含有滯態(tài)液（Reagent B）的細胞培養(yǎng)液到50毫升錐形離心管
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）到培養(yǎng)瓶，清洗整個細胞表面
• 移出清理液合并到50毫升錐形離心管
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 手擊振動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液，充分混勻
• 移出混勻物合并到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液（保留0.3毫升）
• 手指輕彈混勻細胞

2）懸浮細胞處理

• 準備好108懸浮細胞（淋巴細胞、白細胞、骨髓細胞等）
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘， 速度為300g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻顆粒群
• （選擇步驟）放進臺式離心機離心5分鐘， 速度為300g
• （選擇步驟）小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入15毫升用戶自備的RPMI 1640*細胞培養(yǎng)液，充分混勻細胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)移到到新的75cm2細胞培養(yǎng)瓶
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育16至20小時
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘， 速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升用戶自備的RPMI 1640*細胞培養(yǎng)液，混勻細胞顆粒群
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的滯態(tài)液（Reagent B），混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱，孵育2小時
• 在顯微鏡觀察下，細胞開始收縮，表明細胞處于有絲分裂
• 放進臺式離心機離心5分鐘， 速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升用戶自備的RPMI 1640*細胞培養(yǎng)液，充分混勻
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液（保留0.3毫升）
• 手指輕彈混勻細胞

二．低滲處理有絲分裂細胞

• 用滴管一滴一滴加入xx毫升37℃預(yù)熱的低滲液（Reagent C）到50毫升錐形離心管，輕輕搖動
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育15分鐘
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液（保留0.3毫升）
• 手指輕彈混勻細胞

三．固定細胞

1．用滴管一滴一滴加入xx毫升預(yù)冷的固定工作液到50毫升錐形離心管，輕輕搖動

2．放進冰槽里孵育至少5分鐘

3．放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

4．小心抽去上清液（保留0.3毫升）

5．手指輕彈混勻細胞

6．重復上述步驟1至5，直到沉淀細胞顆粒群為白色（越白越好）

7．加入5毫升固定工作液到50毫升錐形離心管，充分混勻

四．染色體載片制作

1． 先將載玻片置于冰箱里冷卻，然后放在實驗臺上，并排放上5至10張

2． 從高達30至60厘米處向下滴上3滴細胞混勻液在載玻片上，立即吹散開，使其散開或然后拿起載玻片，輕輕拍擊手掌（注意：參見注意事項8）

3． 在顯微鏡下觀察有絲分裂中期的細胞

4． 空氣中晾干載玻片（注意：參見注意事項8）

5． 可以保存在70％酒精里，放進4℃冰箱長達一年。剩下的在固定液里的細胞可以長期保存在－20℃冰箱里

五．染色

• 加入xx毫升預(yù)備液（Reagent F）到小型染色缸（Coplin jar）
• 放進晾干的載玻片孵育30秒
• 取出載玻片，加上xx微升染色液（Reagent G），鋪滿整個細胞表面
• 置入暗室3分鐘
• 放進含有預(yù)備液（Reagent F）的小型染色缸孵育30秒
• 取出載玻片，用用戶自備的無離子水輕輕沖洗3次
• 在暗室里晾干
• 加上xx微升抗淬滅劑（Reagent H）
• 封片
• 在熒光顯微鏡紫外波長下，觀察呈現(xiàn)藍色的細胞染色體
• 將熒光圖像轉(zhuǎn)換為黑白圖像，顯示G帶條帶進行分析