保存方式

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器

載玻片：用于組織染色操作

解剖針：用于植物組織解剖

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于用于細(xì)胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

方法一：活體組織染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

方法二：組織固定染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升固著液（Reagent B）
• 室溫下，孵育3小時(shí)，避免干化
• 小心移去固著液（Reagent B）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升離析液（Reagent C）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去離析液（Reagent C）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）

• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

方法三、培養(yǎng)植物細(xì)胞脫離染色

• 準(zhǔn)備1瓶25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開(kāi)始）
• 移取10微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 移出1 X 106細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 再加入xx微升染色液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升清理液（Reagent A），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移，表明超氧陰離子含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――

紅色熒光增強(qiáng)，表明超氧陰離子含量高

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色皿

2）加入xx微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm――

RFU增高，表明超氧陰離子含量高