活體組織氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途
活體組織氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基
二氯二氫熒光素二乙酯，在組織氧化損傷條件下，產生熒光，來定量檢測組織內活性氧族的
生成和增加的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。
適宜于活體動物組織的分析?？梢员挥糜诩毎蛲觥⑿盘杺鬟f、衰老、代謝和營養(yǎng)學等的研
究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。
技術背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自
由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基
（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧
亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自
由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen
Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯
（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是
取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級
產品，一種*自由通過細胞膜，并在細胞內長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化
氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產生熒光。據(jù)此測定組織細胞內活性
氧族的濃度。
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀釋液（Reagent C） 毫升
產品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有
效保證6 月
用戶自備
50 毫升錐形離心管：用于組織收集的容器
15 毫升錐形離心管：用于工作液配制和組織處理的容器
1.5 毫升離心管：用于工作液配制的容器
6 孔細胞培養(yǎng)板：用于組織染色的容器
培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育
熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織1
熒光分光光度儀：用于組織熒光定量檢測
實驗步驟
方法一：新鮮組織薄片定性檢測
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 稀釋
液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的
15 毫升錐形離心管，加入xx 毫升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室
里。然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織
2． 放進預冷的50 毫升錐形離心管
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A）浸泡15 秒
4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
5． 即刻用刀片切離組織為1cm X 1cm 大小的片狀組織
6． 用鑷子將組織薄片放進6 孔培養(yǎng)板的一個孔
7． 加xx 毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液
8． 放進37℃培養(yǎng)箱孵育20 分鐘，避免光照（注意：如果組織薄片較厚，可以增加孵育時
間至60 分鐘）
9． 小心抽去染色工作液
10．加入xx 毫升清理液（Reagent A）
11．用鑷子將組織薄片放在載玻片上
12．壓片
13．即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm――熒光增
強，表明活性氧族（ROS）含量高
方法二：組織勻漿定量檢測
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 稀釋
液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的
1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室里。
然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量100 毫克
2． 放進預冷的50 毫升錐形離心管
3． 加xx 毫升的清理液（Reagent A）
4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
5． 即刻用刀片切碎組織
6． 放進一個預冷的15 毫升錐形離心管
7． 加入xx 毫升預冷的稀釋液（Reagent C）
8． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
9． 即刻放入預冷的DOUNCE 勻漿器
10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化） 2
11．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
12．置入冰槽里備用
13．移取5 微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測：建議使用Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒
14．移取xx 微升組織勻漿物（樣品：100 微克蛋白）或xx 微升稀釋液（Reagent C）（背景
對照）到1 毫升比色杯里
15．加入xx 微升升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液
16．上下傾倒混勻
17．放進37℃恒溫水槽孵育20 分鐘，避免光照
18．即刻放進熒光分光光度儀檢測：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm——（樣品RFU-對
照RFU）＝實際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高
注意事項
1． 本產品為20 次（組織勻漿）或8 次（組織薄片）操作，包括背景對照
2． 建議使用新鮮組織，手術切除后1 小時內的樣品
3． 操作時，須戴手套
4． 系統(tǒng)檢測，背景對照只需1 次
5． 染色工作液配制后1 小時內使用為佳
6． 孵育時，須避免光照
7． 如果組織薄片較厚，可以增加孵育時間至60 分鐘
8． 組織勻漿時，切莫過度
9． 建議組織染色完成后，即刻進行熒光定量或定性分析
10．本公司提供陽性對照甲萘醌溶液，觀察組織熒光增強現(xiàn)象
11．本公司提供系列活性氧檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產品經鑒定熒光清晰