主要用途

細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)線粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對(duì)熒光峰值的變化，來(lái)測(cè)定細(xì)胞線粒體中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞（動(dòng)物、人體等）內(nèi)線粒體鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中線粒體鈣離子在調(diào)節(jié)線粒體代謝、保持線粒體的ATP產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞需求，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。線粒體鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體純化。Rhod-2，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產(chǎn)物，一種與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光，同時(shí)其正電荷特性，特異性地聚集在線粒體里， 由此用于測(cè)定線粒體內(nèi)鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，來(lái)定量測(cè)定線粒體的鈣濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）       40毫升

染色液（Reagent B）  30微升

介導(dǎo)液（Reagent C）      600微升

飽和液（Reagent D）        2毫升

陰性液（Reagent E）        2毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm
• 測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)

• 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔（不含細(xì)胞）、大對(duì)照孔（不含細(xì)胞）
• 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
• 加入100微升飽和液（Reagent D）到大對(duì)照孔里
• 加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照孔里
• 分別加入10微升染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照
• 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12和13一次 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計(jì)算樣品線粒體鈣離子濃度 

【（樣品RFU－空白對(duì)照孔R(shí)FU）÷（大對(duì)照孔R(shí)FU－樣品RFU）】X 570（納摩爾；解離常數(shù)）