1.不同的細(xì)胞，喜歡的環(huán)境是不一樣的。

    這個不僅僅是說培養(yǎng)基的不同，還有就是細(xì)胞生長的空間密度問題。

有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長，生長狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細(xì)胞。譬如內(nèi)皮細(xì)胞。而有一些是細(xì)胞是數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會生長的比較好，譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞。尤其是巨噬細(xì)胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞，這樣細(xì)胞狀態(tài)會比較好。并且巨噬細(xì)胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長成相連在一起的一滿片的時候，細(xì)胞形態(tài)基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不好的。所以在養(yǎng)細(xì)胞的時候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長空間密度問題。

2.對于有些人總是會遇到養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好的問題。

    這個其實(shí)是有一個方法可以改善的。對于貼壁細(xì)胞，如果細(xì)胞形態(tài)不好，（或者細(xì)胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時候進(jìn)行如下操作：

首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養(yǎng)基，進(jìn)行預(yù)吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。（巨噬細(xì)胞我們只吹打，不消化的）

其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況。10分鐘觀察一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點(diǎn)，已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細(xì)胞生長情況以及形態(tài)。

如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次。直到找到細(xì)胞形態(tài)。其中要注意，結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長情況。喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時候再傳。反之亦然。

3.關(guān)于培養(yǎng)瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基的量的問題。本文由上海哈靈生物科技有限公司提供

    這個是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會長得比較好。（可能也是競爭很大，有優(yōu)勝劣汰吧。）對于生長速度快的細(xì)胞，易生長的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會更好。但是要注意換液掌握。

4.關(guān)于選擇培養(yǎng)瓶的問題。

    生長速度快的細(xì)胞在玻璃瓶內(nèi)生長的狀態(tài)會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細(xì)胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內(nèi)的生長狀態(tài)也比塑料瓶內(nèi)好。這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁。生長速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對“更安逸"的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。

所以對于生長速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度慢的細(xì)胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細(xì)胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點(diǎn)，比如剛剛復(fù)蘇的時候，或者原代培養(yǎng)的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點(diǎn)。

5.傳代時消化的問題。

    可以這樣說，對于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對這個細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好至關(guān)重要的考驗(yàn)。

很多同學(xué)都遇到過這個問題，自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長的還挺好的，可是傳過幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了，狀態(tài)越來越差勁了。對于這個問題，可以非?？隙ǖ卣f，你的消化環(huán)節(jié)出問題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了。所以，越長越差。

在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題就是，細(xì)胞的生長狀態(tài)是不一樣的，每一個細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時間對細(xì)胞是不公平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會有脾氣啊。。。

具體操作：

1）.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗1-2遍，（這是前奏，即為*步，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。

2）.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。即為第二步（你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過的細(xì)胞對比觀察看誰長的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對胰酶的敏感度了。）

3）.吸干凈瓶內(nèi)剩余液體，加入0.3ml左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。（你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對比。）這是第三步。

4）.然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)（根據(jù)實(shí)際情況你自己把握）。這是第四步。

    其實(shí)還可以有第五步，對于特別難消化的細(xì)胞和對胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能大限度地將胰酶對細(xì)胞的損傷降到低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠優(yōu)。

當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒必要第三步第四步了。這個是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會的。建議你接受一個新細(xì)胞時把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來做比較，去摸索好細(xì)胞對胰酶的要求。便于你后續(xù)實(shí)

驗(yàn)的開展。

    將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細(xì)胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以大程度地把細(xì)胞吹打成單個單個的狀態(tài)，不成片不連體。

因?yàn)榧?xì)胞生長的時候肯定是要相互，大部分的細(xì)胞都是要成片生長的，尤其是對于貼壁細(xì)胞，單個細(xì)胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會死亡。所以，消化傳代的時候一定要將細(xì)胞消化成單個單個的獨(dú)立狀態(tài)，這個是非?？季磕愕墓Ψ虻模?/span>

    細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個，因?yàn)樗麤]有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對他吹打的力分散開細(xì)胞。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度啊，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理啊。既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開。這個是很重要的一點(diǎn)。尤其是對于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活去死的致命點(diǎn)。像Caco-2細(xì)胞就是如此。

另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長滿的時候才去消化傳代。要在細(xì)胞長到70%左右的時候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長中已經(jīng)有疊層生長的時候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了。

6.關(guān)于換液傳代時候洗瓶的問題。

    對于用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，你在洗的時候如果是用無血清1640去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會比用DMEM洗的長的要好。同樣，用1640培養(yǎng)的也有這個現(xiàn)象。

如果不嫌麻煩的話，可以用PBS來洗，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對于有些細(xì)胞會更勝*。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。

再補(bǔ)充一點(diǎn)：

    傳代時PBS洗是很重要的一步，近發(fā)現(xiàn)，用PBS就可以把細(xì)胞消化開來。加入PBS放置10-15分鐘，有些需要更長的時間，等到細(xì)胞一個個分離開來的時候，就可以直接吹打下來，但是和胰酶消化一樣，要控制好時間，不能時間太過了，要不然損傷細(xì)胞，細(xì)胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。這個方法對于某些細(xì)胞是很管用的。有些細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個的時候，或者臨時沒有胰酶了，可以選用此方法。不過一定要試試，看是否適合你的細(xì)胞。