細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過含硫多肽底物以及特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP9的水解，釋放出巰基，進而使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶9的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細胞并不儲備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號傳遞到細胞后才臨時合成，合成的MMPs以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶-9，又稱明膠酶B（gelatinase-B ）或IV型膠原酶（type IV collagenase），其前體分子量為92kDa，激活后分子量為82kDa以及更小。它的作用目標(biāo)是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白（laminin）、前體腫瘤壞死因子-α（pro-TNF-α）和白細胞介素及其受體。基質(zhì)金屬蛋白酶-9與腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、血管形成、斑禿（alopecia）等疾病有關(guān)。基于含硫多肽（thiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，在特異性抑制劑存在與否的條件下，受到MMP9的水解，釋放出巰基（sulfhydryl group），進而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量測定組織基質(zhì)金屬蛋白酶9的特異活性。基質(zhì)金屬蛋白酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

MMP9

Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5 →  Ac-PLG-SH  +  4-methyl-pentanoyl-LG-OC2H5 

Inhibitor（＋/－）

DTNB  +  Ac-PLG-SH  →   TNB +  Ac-PLG-S -S-TNB

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                 120毫升

裂解液（Reagent B）                  10毫升

緩沖液（Reagent C）                  15毫升

反應(yīng)液（Reagent D）                  1.5毫升

底物液（Reagent E）                       50微升

陰性液（Reagent F）                   500微升

專性液（Reagent G）                   200微升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent G）避免光照；有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準備

1. 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2. 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5. 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩15秒

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15. 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30031.1）

16. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔1分鐘，讀數(shù)15次（共15分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 樣品背景對照測定

1． 移取212.5微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入2.5微升陰性液（Reagent F）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測定

1． 移取212.5微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入2.5微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、樣品非特異活性測定

檢測開始前，分別移取10微升專性液（Reagent G）和待測樣品（注意：100微克細胞裂解蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1． 移取202.5微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入2.5微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

六、計算樣品活性

（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（二） 樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

七、 酶標(biāo)儀測定

（一） 樣品總活性檢測

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景和樣品活性

2． 分別移取84微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中所有孔里

3． 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent D）到所有孔里

4． 加入1微升陰性液（Reagent F）到樣品背景孔里

5． 加入1微升底物液（Reagent E）到樣品活性孔里

6． 輕輕搖動96孔板

7． 在37℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入5微升待測樣品（50微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動96孔板

10． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

11． 活性計算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.1（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（二） 樣品非特異性活性檢測

檢測開始前，分別移取5微升專性液（Reagent G）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品

2． 移取79微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 加入10微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 加入1微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動96孔板

6． 加入10微升上述預(yù)處理的待測樣品

7． 輕輕搖動96孔板

8． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

9． 活性計算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.1（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（三） 樣品特異性活性計算

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（10個樣本；比色皿）和50次（25個樣本；96孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 專性液（Reagent G）嚴禁反復(fù)凍融；有效期為3個月

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品準備要點如下：

a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－HL12197）

7． 建議使用比色皿測定

8． 樣品須澄清，至關(guān)重要

9． 加樣后3秒內(nèi)比色測定

10． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)15分鐘

11． 比色測定后，比色皿須清洗

12． 樣本測定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

13． 待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/50微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HL30031.1）

14． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

15． 如果檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9抑制劑，在加入底物液（Reagent E）前，37℃下孵育30分鐘

16． 可以檢測部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶9，則可以省去非特異活性檢測步驟

17． 基質(zhì)金屬蛋白酶9酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位抑制劑敏感性酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的含硫多肽底物

18． 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感