主要用途

基因甲基化特異性PCR擴(kuò)增（MSP）試劑盒是一種旨在通過(guò)設(shè)計(jì)符合胞嘧啶轉(zhuǎn)化的特殊引物，對(duì)轉(zhuǎn)化基因組的CpG島區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探測(cè)基因甲基化信息的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诟改赣∮洝染色體研究、腫瘤抑制基因等表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增效率顯著。

技術(shù)背景

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“"的區(qū)域，稱為“島"（ island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬(wàn)個(gè)島。這些島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的位置。島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

轉(zhuǎn)化樣品：經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的目標(biāo)DNA分子

特異引物：用于甲基化基因擴(kuò)增的引導(dǎo)DNA分子

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

1．針對(duì)一個(gè)樣本，每次移出15微升擴(kuò)增液（Reagent A）到PCR管

2．加入1微升用戶自備的的轉(zhuǎn)化或野生型DNA樣品（總量100納克）

3．分別加入1微升用戶自備的甲基化特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）

4．再加入7微升補(bǔ)充液（Reagent B）（反應(yīng)總量為25微升）

5．即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）

6．加入50微升PCR級(jí)礦物油（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）

7．即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為60次操作

2．操作時(shí)，須戴手套

3．建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染

4．轉(zhuǎn)化后的DNA樣本須保存在－20℃冰箱里，否則容易降解；同時(shí)盡快進(jìn)行擴(kuò)增等后續(xù)操作

5．一個(gè)特定基因的甲基化檢測(cè)通常包括轉(zhuǎn)化、PCR和直接測(cè)序三步。PCR用于篩選和定位，可以發(fā)現(xiàn)0.1%甲基化；測(cè)序是精確定位，是分析金標(biāo)準(zhǔn)

6．一個(gè)特定基因的甲基化特異性PCR通常包括三組PCR： 野生型（W）、轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）

7．甲基化特異性PCR的引物設(shè)計(jì)原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個(gè)位點(diǎn)；位點(diǎn)須在3端；PCR片段長(zhǎng)度在80－250堿基；三組引物取自同一位點(diǎn)，通過(guò)長(zhǎng)度變化獲得相同的Tm，并在電泳上有所區(qū)別。

8．直接測(cè)序的引物設(shè)計(jì)原則是：引物不能含有CPG位點(diǎn)；引物含有足夠多的C（不和G相連）；采用巢式引物

9．基因甲基化區(qū)域選擇原則：如果是一個(gè)檢測(cè)的基因，首先，選擇啟動(dòng)子部位；第二，選擇足夠多的CPG位點(diǎn)；第三、 選擇200堿基以上區(qū)域，且GC超過(guò)50%

10．通過(guò)1.8%瓊脂糖凝膠或15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U"Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M"Primer能被擴(kuò)增

11．組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U"和“M"同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析

12．根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）

13．建議使用軟件測(cè)算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）

14．在-20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融