主要用途

動物細胞V型氫ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶連續(xù)反應光度法定量檢測試劑是一種旨在使用V型氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，在特異性抑制劑存在與否的情況下，受到V型氫ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物細胞裂解懸液等V型H^＋-ATP酶的活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

氫ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導過程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type或P型）、真細菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約100kd蛋白；真細菌型存在于葉綠體、線粒體和細菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡型存在于真核生物細胞器的囊泡系統(tǒng)。其中植物質(zhì)膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細胞膜上重要的功能酶，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶（V type H^＋-ATPase）是V型ATP酶的主要成員，400至600kd，含有胞漿復合體（V1）和胞膜復合體（V0），通過產(chǎn)生電子泵，轉(zhuǎn)移質(zhì)子，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級活性轉(zhuǎn)運體的動力。V型氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。同時利用細胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運出細胞，產(chǎn)生并保持細胞膜或細胞器兩側(cè)氫離子的電化學梯度，為一系列次級轉(zhuǎn)運體和通道蛋白對各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運提供能量。動物V型氫ATP酶還參與細胞內(nèi)以及細胞器（微粒體和溶酶體等）pH水平、液體分泌、跨膜電壓等多種生理過程的調(diào)節(jié)。基于底物ATP，在V型氫ATP酶敏感性抑制劑巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）存在與否的情況下，受到V型氫ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析V型氫ATP酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             毫升

反應液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）          毫升

陰性液（Reagent G）           毫升

專性液（Reagent H）              微升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。

一、 樣品準備（總蛋白制備）

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如動物細胞裂解樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xxx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘或30分鐘

四、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘或30分鐘

五、 樣品非特異活性測定

實驗開始前，移取50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白）到1.5毫升離心管，加入xx微升專性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混勻后，放進37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘

6． 加入60微升上述預處理的待測樣品

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘或30分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5． 建議使用動物細胞微粒體、囊泡樣品；本公司提供的動物細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒（10169.1）

6． 加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻光度測定

7． 反應測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘

8． 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

9． 光度測定后，比色皿須清洗*

10． 建議待測樣本總蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

11． 樣品特異活性是指巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）敏感性V型氫ATP酶活性

12． V型氫ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確