通用型細菌16S rDNA 熒光定量PCR擴增檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

通用型細菌16S rDNA 熒光定量PCR擴增檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，針對微生物樣本DNA進行保守性序列PCR擴增，實時檢測和定量分析擴增產(chǎn)物的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于各種樣品，包括血液、體液、組織、土壤等的細菌拷貝數(shù)的定量檢測。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強。

技術(shù)背景

16SrRNA作為非培養(yǎng)依賴性標記的分子指模（fingerprinting）技術(shù)，有別于傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)技術(shù)，用于研究微生物的分類學（phylogenetics）。核糖體RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物體內(nèi)，且結(jié)構(gòu)與功能進化保留；容易分離和識別；其一級和二級結(jié)構(gòu)具有高度進化保守區(qū)域（conserved region）和物種特異性可變區(qū)域（variable region）；其基因序列變異非常緩慢，且不會發(fā)生平行基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分；23S不穩(wěn)定；而微生物16SrRNA基因較為穩(wěn)定，初級結(jié)構(gòu)含有1500個堿基。通過引物設(shè)計，擴增產(chǎn)物。SYBR綠色熒光染料，作為DNA結(jié)合染料，可以和擴增子（amplican）上雙鏈DNA的任一小溝（minor groove）結(jié)合，而發(fā)出熒光信號。根據(jù)每一循環(huán)的熒光強度來確定擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量，并用循環(huán)閾值（threshold cycle；Ct）表示，計算獲得拷貝數(shù)。

產(chǎn)品內(nèi)容

反應液（Reagent A）          300微升

染色液（Reagent B）           20微升

引物液（Reagent C）              40微升

補充液（Reagent D）          500微升

封隔液（Reagent E）          1.5毫升

產(chǎn)品說明書                 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品預處理的容器

1.5毫升離心管：用于預處理的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

PCR管：用于樣品擴增操作的容器

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作：

1． 一次反應總量為25微升

2． 移取15微升反應液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

3． 加入5微升待測的DNA模板（或 100納克）

4． 加入1微升染色液（Reagent B）

5． 加入2微升引物液（Reagent C）

6． 加入3微升補充液（Reagent D）至總?cè)萘繛?/span>25微升

7． 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒

8． 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：參見注意事項10）

9． 即刻放進熒光定量PCR儀

10． 熒光定量PCR反應程序為：

11． 進行數(shù)據(jù)分析

（1） 采用比較閾值分析法（ΔΔCt），即相對定量，計算樣品拷貝數(shù)：建議使用用戶自備的對照樣品或大腸桿菌細菌株

（2） 或采用標準曲線法，即絕對定量，計算樣品拷貝數(shù)

（3） 細菌量單位計算：拷貝數(shù)/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數(shù)/微克樣品DNA（copies/µg）

A） 根據(jù)上述方法獲得待測樣品拷貝數(shù)（Q）

B） 根據(jù)下列公式計算單位拷貝數(shù)，即拷貝數(shù)/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數(shù)/微克樣品DNA（copies/µg）

C：單位拷貝數(shù)

Q：待測樣品拷貝數(shù)

VDNA：DNA萃取后的總?cè)萘?/span>

VPCR：反應體系中DNA模板容量（5微升）

VEXT：原始樣品總?cè)萘?/span>

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次PCR反應

2． 操作時，須戴手套

3． 樣品操作注意生物安全

4． 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀

5． 建議整個操作在4℃下進行

6． 建議使用帶濾芯的槍頭，避免交叉污染

7． 使用時，避免污染母液