主要用途

細(xì)胞總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團(tuán)，使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）脂肪酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂質(zhì)分子的酯鍵（ester bond）的水解。在人體中，其來(lái)源于胰腺產(chǎn)生。在消化系統(tǒng)中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），產(chǎn)生1個(gè)分子甘油（glycerol）和3個(gè)分子游離脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶異常增高與胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、腎病、唾液腺炎癥、腸道阻塞等相關(guān)；異常降低則與胰腺中脂肪酶產(chǎn)生細(xì)胞的性損傷有關(guān)。脂肪酶的活性檢測(cè)是臨床診斷的指標(biāo)之一?；?span style=";font-family:'Times New Roman';font-size:12px">脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產(chǎn)生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團(tuán)（－SH），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）           毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）           毫升

反應(yīng)液（Reagent D）           毫升

底色液（Reagent E）            毫升

補(bǔ)充液（Reagent F）            毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書              1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離鐵壁細(xì)胞

DOUNCE勻漿器：用于組織裂解

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或96孔板：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

11． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）

13． 將所有細(xì)胞勻漿物移入1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔10分鐘，讀數(shù)4次（共30分鐘），并置零 

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底色液（Reagent E）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 在37℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入50微升待測(cè)樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底色液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入50微升待測(cè)樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

五、 計(jì)算樣品活性

六、酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）到樣品孔里

4． 加入xx微升陰性液（Reagent F）到背景對(duì)照孔里

5． 分別加入xx微升底色液（Reagent E）到所有孔里

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在37℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入10微升待測(cè)樣品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)）

11． 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次（96孔板，包括50次樣品和50次背景對(duì)照）和12次（比色皿，包括12次樣品和12次背景對(duì)照）操作

2． 本產(chǎn)品檢測(cè)范圍是40至1600毫單位/毫升

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 每次樣品測(cè)定，需要背景測(cè)定一次

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測(cè)

7． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定

8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

9． 建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

10． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

11． 脂肪酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇

12． 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品