本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷

實驗原理

試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、陰性和陽性對照、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），判定陰陽性。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。

2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。

3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。

注：標本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

1.  酶標儀（450nm）

2.  高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.  37℃恒溫箱

4.  蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

名稱 96孔配置 48孔配置 備注

微孔酶標板 96孔 48孔 無

陰性對照 0.3mL 0.3mL 無

陽性對照 0.3mL 0.3mL 無

樣本稀釋液 6mL 3mL 無

檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋

底物A 6mL 3mL 無

底物B 6mL 3mL 無

終止液 6mL 3mL 無

封板膜 2張 2張 無

說明書 1份 1份 無

自封袋 1個 1個 無

注意事項

1.  嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2.  洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.  消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.  底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5.  避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6.  在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.  平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.  任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9.  不能使用過期產(chǎn)品。

10.  如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔，陰性、陽新對照孔各加50μL對照品；

3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結(jié)果計算

1. 陰性對照OD值：小于0.2。

2. 陽性對照OD值：大于0.8。

3. 陽性判斷（Cut-Off值）：陰性對照OD值+0.15，樣本OD值大于閾值，判定為陽性，反之，為陰性。