活體細(xì)胞溶酶體膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

活體細(xì)胞溶酶體膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)吖啶橙吸收和細(xì)胞內(nèi)再分布檢測(cè)技術(shù)，選擇性地聚集在溶酶體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，即存在于或由溶酶體釋放到細(xì)胞漿的熒光染料的不同熒光強(qiáng)度變化，來(lái)分析和觀察溶酶體膜通透性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞溶酶體（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）膜通透性的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

溶酶體（lysosome）是一種動(dòng)態(tài)性的、多態(tài)性的、含有水解酶的細(xì)胞器，具有接受和降解來(lái)自于分泌性、內(nèi)吞性（endocytic）、自噬性（autophagic）、吞噬性（phagocytic）膜運(yùn)轉(zhuǎn)通路中的大分子。其功能是膜依賴性，具有解毒和防御作用。溶酶體膜是溶酶體內(nèi)基質(zhì)和胞漿之間的生理屏障，為整合性糖蛋白，防止細(xì)胞自我降解。一旦溶酶體膜去穩(wěn)定（destabilization），例如堿性化或內(nèi)容物移位（translocation），將導(dǎo)致質(zhì)子和水解酶外漏，而造成細(xì)胞器功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞壞死、凋亡，以及病理癥狀，例如朊病毒腦?。╬rion encephalopathies）、阿茨罕默病、心肌缺血、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、補(bǔ)體激活型肺損傷（complement activation-produced lung injury）、急性組織損傷等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶體膜去穩(wěn)定性或去完整性的標(biāo)志之一，溶酶體內(nèi)容物大量釋放到胞漿中，直接影響細(xì)胞的存活。吖啶橙（acridine orange；AO）是一種親溶酶體（lysomotropic）異染性（metachromatic）的熒光染料，在完整的溶酶體內(nèi)，為質(zhì)子化（protonated）寡聚體（oligomeric）形式，呈現(xiàn)紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm），而在胞漿內(nèi)，為單體去質(zhì)子化形式，呈現(xiàn)綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)528nm）。吖啶橙進(jìn)入溶酶體后重新分布，即吸收和細(xì)胞內(nèi)再分布（uptake and redistribution），用于分析溶酶體膜通透性狀況。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）           60毫升

染色液（Reagent B）          100微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、貼壁細(xì)胞染色

1．準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見(jiàn)注意事項(xiàng)7）

2．小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3．小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4．小心抽去清理液

5．小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

6．小心沿著孔壁加入5微升染色液（Reagent B）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

7．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照

8．小心抽去染色液

9．小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔

10．小心抽去清理液

11．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9和10一次

12．小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔

13．選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm――紅色熒光減弱，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

（B）使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

二、懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色

1．將懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 106細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管

2．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

3．小心抽去上清液

4．加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群

5．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

6．小心抽去上清液

7．加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群

8．加入5微升含有染色液（Reagent B），充分混勻 

9．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照

10．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

11．小心抽去染色液

12．加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群

13．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心抽去上清液

15．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14一次

16．加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群

17．選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

a)進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：FL1（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)528nm），或FL3（激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm）觀察10000個(gè)細(xì)胞以上――

FL1：波峰右移，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

FL3：波峰左移，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

b)或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm――紅色熒光減弱，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

c)或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：

激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)

激發(fā)波長(zhǎng)555nm，散發(fā)波長(zhǎng)617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增強(qiáng)