<p>犬超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）<br />
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)<br />
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定犬血清，血漿及相關(guān)<br />
液體樣本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。<br />
實(shí)驗(yàn)原理：<br />
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中犬超氧化物歧化酶（SOD）水平。用純化的抗- SOD<br />
抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），<br />
再與HRP 標(biāo)記的SOD 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物<br />
TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏<br />
色的深淺和樣品中的超氧化物歧化酶呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD<br />
值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中犬超氧化物歧化酶（SOD）濃度。<br />
試劑盒組成：<br />
試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存<br />
說(shuō)明書(shū)1 份1 份<br />
封板膜2 片（48） 2 片（96）<br />
密封袋1 個(gè)1 個(gè)<br />
酶標(biāo)包被板1&times;48 1&times;96 2-8℃保存<br />
標(biāo)準(zhǔn)品：180U/mL 0.5ml&times;1 瓶0.5ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml&times;1 瓶1.5ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
酶標(biāo)試劑3 ml&times;1 瓶6 ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
樣品稀釋液3 ml&times;1 瓶6 ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
顯色劑A 液3 ml&times;1 瓶6 ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
顯色劑B 液3 ml&times;1 瓶6 ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
終止液3ml&times;1 瓶6ml&times;1 瓶2-8℃保存<br />
濃縮洗滌液（20ml&times;20 倍）&times;1 瓶（20ml&times;30 倍）&times;1 瓶2-8℃保存<br />
樣本處理及要求：<br />
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上<br />
清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。<br />
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心<br />
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次<br />
離心。<br />
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程<br />
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。<br />
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/<br />
分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞<br />
濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20 分<br />
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。<br />
2<br />
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?lt;br />
用。標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器<br />
將標(biāo)本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待<br />
檢測(cè)，其余冷凍備用。<br />
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上<br />
進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.<br />
7. 不能檢測(cè)含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。<br />
操作步驟<br />
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，、第二孔中分別加標(biāo)<br />
準(zhǔn)品100&mu;l，然后在、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50&mu;l，混勻；然后從孔、第二<br />
孔中各取100&mu;l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50&mu;l，<br />
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50&mu;l 棄掉，再各取50&mu;l 分別加到第五、第六孔<br />
中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各<br />
取50&mu;l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50&mu;l，混<br />
勻后從第七、第八孔中分別取50&mu;l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)<br />
品稀釋液50&mu;l，混勻后從第九第十孔中各取50&mu;l 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50&mu;l，<br />
濃度分別為120U/mL，80U/mL ，40U/mL，20U/mL， 10U/mL）。<br />
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣<br />
品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40&mu;l，然后再加待測(cè)樣品10&mu;l（樣<br />
品終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混<br />
勻。<br />
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。<br />
4. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用。<br />
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此<br />
重復(fù)5 次，拍干。<br />
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50&mu;l，空白孔除外。<br />
7. 溫育：操作同3。<br />
8. 洗滌：操作同5。<br />
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50&mu;l，再加入顯色劑B50&mu;l，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色<br />
15 分鐘.<br />
10. 終止：每孔加終止液50&mu;l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。<br />
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止<br />
液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。<br />
注意事項(xiàng)：<br />
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未<br />
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。<br />
2． 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。<br />
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間<br />
控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。<br />
4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD 值<br />
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔孔的OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)<br />
算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)（&times;n&times;5）。<br />
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。<br />
6． 底物請(qǐng)避光保存。<br />
3<br />
7． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).<br />
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。<br />
9． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。<br />
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。<br />
計(jì)算：<br />
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，<br />
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD<br />
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋<br />
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)<br />
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值<br />
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋<br />
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。<br />
（此圖僅供參考）<br />
試劑盒性能：<br />
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.92 以上。<br />
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15%<br />
檢測(cè)范圍：<br />
5U/mL -150U/mL<br />
保存條件及有效期：<br />
1.試劑盒保存：2-8℃。<br />
2．有效期：6 個(gè)月</p>