組織內(nèi)蛋白氧化(羰基化;carbonyl)比色法測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版) 主要用途 組織內(nèi)蛋白氧化(羰基化;carbonyl)比色法測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)蛋白質(zhì)羰基與2,4-二硝基酚聯(lián)胺反應(yīng), 產(chǎn)生蛋白質(zhì)腙復(fù)合物后峰值的變化,即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中羰基含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技 術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)樣品蛋白質(zhì)羰基的 含量檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 蛋白質(zhì)氧化是由于活性氧直接誘導(dǎo)或氧化應(yīng)激產(chǎn)物間接誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子的共價(jià)修飾(covalent modification),其中包括體外氧化劑,以及衰老、疾病所致。氧化還原循環(huán)中的陽(yáng)離子,例如亞鐵離子或銅 離子,可以與蛋白分子陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,一旦受到過(guò)氧化氫或氧分子的攻擊,致使蛋白分子上脯氨酸 (proline)、精氨酸(arginine)、賴(lài)氨酸(lysine)、蘇氨酸(threonine)、組氨酸(histidine)轉(zhuǎn)化為羰基衍 生物(carbonyl derivatives)。羰基是由碳原子和氧原子雙鍵構(gòu)成的功能性基團(tuán)。蛋白質(zhì)羰基衍生物化學(xué)性能 穩(wěn)定,其羰基化含量成為普遍的氧化應(yīng)激活性氧的指標(biāo),更是蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志?;诘鞍踪|(zhì)羰基與2,4- 二硝基酚聯(lián)胺(2,4-dinitrophenylhydrazine;DNPH)反應(yīng),形成希夫堿,產(chǎn)生蛋白質(zhì)腙復(fù)合物(proteinhydrazone), 在分光光度儀顯示吸光峰值的變化(370nm波長(zhǎng)),來(lái)定量測(cè)定羰基含量。其反應(yīng)系統(tǒng)為: Protein carbonyls + DNPH → protein- hydrazone 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液(Reagent A) 毫升 裂解液(Reagent B) 毫升 去干擾液(Reagent C) 毫升 反應(yīng)液(Reagent D) 瓶 陰性液(Reagent E) 毫升 沉淀液(Reagent F) 毫升 凈化液(Reagent G) 毫升 處理液(Reagent H) 毫升 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份 保存方式 保存去干擾液(Reagent C)和反應(yīng)液(Reagent D)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;反應(yīng)液(Reagent D)避免光照;陰性液(Reagent E)、沉淀液(Reagent F)和處理液(Reagent H)具有腐蝕性,注意操作 安全;凈化液(Reagent G)具有揮發(fā)性,注意密閉瓶蓋;有效保證6 月 用戶(hù)自備 2 1.5 毫升離心管:用于樣品操作的容器 2 毫升離心管:用于樣品反應(yīng)的容器 15 毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器 DOUNCE 勻漿器:用于裂解組織 微型臺(tái)式離心機(jī):用于萃取反應(yīng)產(chǎn)物 渦旋震蕩儀:用于混勻反應(yīng) 96 孔板:用于比色的容器 酶標(biāo)儀:用于比色分析 實(shí)驗(yàn)步驟 一、樣品準(zhǔn)備 1. 手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重以確定200 毫克組織重量 2. (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管 3. (選擇步驟)加入xx 毫升清理液(Reagent A)清洗1 次 4. 移入到一個(gè)液氮凍存管 5. 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)一夜 6. 次日從液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融) 7. 放進(jìn)一個(gè)15 毫升錐形離心管 8. 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液(Reagent B) 9. 強(qiáng)力渦旋震蕩30 秒,充分混勻 10.放進(jìn)DOUNCE 勻漿器里勻漿80 下 11.將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管 12.放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘,速度為10000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415) 13.小心移取800 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管 14.加入xx 微升去干擾液(Reagent C),混勻 15.室溫下孵育15 分鐘 16.放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘,速度為6000g 17.小心移取上清液到新的1.5 毫升離心管 18.移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè) 19.即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作(注意:建議在1 月之內(nèi)完成檢測(cè)) 二、樣品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液(Reagent D)取出,加入xx 毫升陰性液(Reagent E), 混勻,標(biāo)記為反應(yīng)工作液,置入冰槽里備用,避免光照。然后進(jìn)行下列操作。 1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如組織裂解萃取液樣品等),置于冰槽里 2. 設(shè)定好分光光度儀:波長(zhǎng)370nm,并置零 3. 準(zhǔn)備2 個(gè)2 毫升離心管,標(biāo)記為背景管和樣品管 4. 分別移取200 微升待測(cè)樣品到背景管和樣品管 5. 加入xx 微升反應(yīng)工作液到樣品管 6. 加入xx 微升陰性液(Reagent E)到背景管 3 7. 分別渦旋震蕩15 秒 8. 室溫下孵育60 分鐘,每隔15 分鐘渦旋震蕩15 秒,避免光照 9. 分別加入xx 毫升沉淀液(Reagent F) 10.分別渦旋震蕩15 秒 11.置于冰槽里孵育5 分鐘 12.放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘,速度為10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415) 13.分別小心抽去上清液 14.分別加入xx 毫升凈化液(Reagent G) 15.分別渦旋震蕩15 秒 16.放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘,速度為10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415) 17.分別小心抽去上清液 18.分別加入xx 微升處理液(Reagent H) 19.分別渦旋震蕩15 秒 20.放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘,速度為10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415) 21.分別移取250 微升上清液到96 孔板里的測(cè)試孔 22.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù) 23.實(shí)際吸光讀數(shù):樣品管讀數(shù)-背景管讀數(shù) 24.計(jì)算樣品含量: 注意事項(xiàng) 1. 本產(chǎn)品為20 次操作 2. 操作時(shí),須戴手套 3. 陰性液(Reagent E)、沉淀液(Reagent F)和處理液(Reagent H)具有腐蝕性,注意操作安全 4. 凈化液(Reagent G)具有揮發(fā)性,注意密閉瓶蓋 5. 每次檢測(cè),需進(jìn)行樣品背景測(cè)定 6. 反應(yīng)工作液配制后,可以在4℃保存,但需在1 周內(nèi)用完;避免-20℃保存 7. 如果酶活性過(guò)低,可以增加反應(yīng)時(shí)間至2 小時(shí) 8. 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為1 至10 毫克/毫升 9. 本公司提供系列氧化檢測(cè)試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感 |