植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途
植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硝基藍四氮唑染料，受到超氧陰離子O2-的還原，產(chǎn)生不溶性藍黑色色素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測樣品超氧陰離子活性氧族的生成和增加的的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的?？梢员挥糜诩毎蛲觥⑿盘杺鬟f、衰老、代謝和營養(yǎng)學等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧陰離子O2-的直接還原，便產(chǎn)生不溶性藍黑色甲暨色素，在分光光度儀下（540nm波長），呈現(xiàn)吸光峰值的變化。據(jù)此定量檢測植物組織細胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿或酶標板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
一、 樣品準備
1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500克組織重量
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12．即刻移入到1.5毫升離心管
13．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford）
14．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長540nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照
三、 背景對照測定
1． 移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升陰性液（Reagent E）
3． 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照
四、 樣品測定
1． 移取微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 加入微升反應(yīng)液（Reagent D） 2
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、計算樣品濃度
六、 酶標板測定
1． 在96孔酶標板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
2． 分別移取200微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
3． 分別加入25微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）到96孔板的所有孔中
5． 輕輕搖動96孔酶標板
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘
7． 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
8． 濃度計算：
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）或80次（酶標板）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 孵育時，避免光照
4． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
5． 建議使用比色皿測定
6． 樣品須澄清，至關(guān)重要
7． 測定值由低到高變化
8． 比色測定后，比色皿須清洗*
9． 如果超氧陰離子活性氧濃度過低，可以延長孵育時間至4小時
10．建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本濃度過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－）
11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
12．本公司提供系列活性氧檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感