活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書

活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基
二氯二氫熒光素二乙酯，在組織氧化損傷條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)組織內(nèi)活性氧族的
生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。
適宜于活體動(dòng)物組織的分析?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研
究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自
由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基
（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧
亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自
由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen
Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯
（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是
取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)
產(chǎn)品，一種*自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化
氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定組織細(xì)胞內(nèi)活性
氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀釋液（Reagent C） 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有
效保證6 月
用戶自備
50 毫升錐形離心管：用于組織收集的容器
15 毫升錐形離心管：用于工作液配制和組織處理的容器
1.5 毫升離心管：用于工作液配制的容器
6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于組織染色的容器
培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育
熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織1
熒光分光光度儀：用于組織熒光定量檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)步驟
方法一：新鮮組織薄片定性檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 稀釋
液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的
15 毫升錐形離心管，加入xx 毫升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室
里。然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織
2． 放進(jìn)預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A）浸泡15 秒
4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
5． 即刻用刀片切離組織為1cm X 1cm 大小的片狀組織
6． 用鑷子將組織薄片放進(jìn)6 孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔
7． 加xx 毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液
8． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20 分鐘，避免光照（注意：如果組織薄片較厚，可以增加孵育時(shí)
間至60 分鐘）
9． 小心抽去染色工作液
10．加入xx 毫升清理液（Reagent A）
11．用鑷子將組織薄片放在載玻片上
12．壓片
13．即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測(cè)）：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm――熒光增
強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高
方法二：組織勻漿定量檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 稀釋
液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的
1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室里。
然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量100 毫克
2． 放進(jìn)預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． 加xx 毫升的清理液（Reagent A）
4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
5． 即刻用刀片切碎組織
6． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
7． 加入xx 毫升預(yù)冷的稀釋液（Reagent C）
8． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
9． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化） 2
11．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
12．置入冰槽里備用
13．移取5 微升組織勻漿物進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)：建議使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒
14．移取xx 微升組織勻漿物（樣品：100 微克蛋白）或xx 微升稀釋液（Reagent C）（背景
對(duì)照）到1 毫升比色杯里
15．加入xx 微升升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液
16．上下傾倒混勻
17．放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20 分鐘，避免光照
18．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm——（樣品RFU-對(duì)
照RFU）＝實(shí)際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次（組織勻漿）或8 次（組織薄片）操作，包括背景對(duì)照
2． 建議使用新鮮組織，手術(shù)切除后1 小時(shí)內(nèi)的樣品
3． 操作時(shí)，須戴手套
4． 系統(tǒng)檢測(cè)，背景對(duì)照只需1 次
5． 染色工作液配制后1 小時(shí)內(nèi)使用為佳
6． 孵育時(shí)，須避免光照
7． 如果組織薄片較厚，可以增加孵育時(shí)間至60 分鐘
8． 組織勻漿時(shí)，切莫過度
9． 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光定量或定性分析
10．本公司提供陽性對(duì)照甲萘醌溶液，觀察組織熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
11．本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰